Film diawali dengan kepulangan Ikal dewasa (Lukman Sardi) ke kampung halamannya. Ia kemudian mengenang kembali masa kecilnya: hari pertama pembukaan kelas baru di sekolah SD Muhammadyah menjadi sangat menegangkan bagi dua guru, Muslimah (Cut Mini) dan Pak Harfan (Ikranagara), serta 9 orang murid yang menunggu di sekolah yang terletak di desa Gantong, Belitong. Sebab, kalau tidak mencapai 10 murid yang mendaftar, sekolah akan ditutup. Harun (Jeffry Yanuar) menyelamatkan mereka.

Ke 10 murid ini yang kemudian diberi nama Laskar Pelangi oleh Bu Muslimah. Lima tahun bersama, Bu Mus, Pak Harfan dan ke 10 murid dengan keunikan dan keistimewaannya masing-masing, berjuang untuk terus bisa sekolah.

Di antara berbagai tantangan berat dan tekanan untuk menyerah, Ikal (Zulfanny), Lintang (Ferdian) dan Mahar (Verrys Yamarno) dengan bakat dan kecerdasannya muncul sebagai pendorong semangat sekolah mereka. Di tengah upaya untuk mempertahankan sekolah, mereka ditinggalkan salah seorang guru karena mendapatkan tawaran yang lebih menarik. Yang paling mengenaskan adalah saat Pak Harfan, yang menjadi "roh" sekolah itu, meninggal.

Film juga berusaha memperlihatkan kondisi sosial daerah Belitong pada tahun 70an dengan antara lain mengontraskan "nasib" sekolah miskin dan sekolah "mewah" milik perusahaan pertambangan, bahkan secara tersurat mempermasalahkan hak pendidikan untuk orang miskin.

Film diakhiri dengan Ikal dewasa bertemu dengan Lintang dewasa (Ario Bayu), yang putus sekolah karena ayahnya meninggal. Ikal perlu menjelaskan keberhasilan impiannya, mendapat beasiswa sekolah ke Paris.