Sinopsis Film "Night at the Museum 2: Battle of the Smithsonian" menceritakan tentang Ben Stiller (penjaga malam Lawrence "Larry" Daley) ini merupakan 'malam' dan 'museum' yang baru. Karakter-karakter yang ditemuinya juga baru, termasuk diantaranya Amy Adams sebagai penerbang wanita Amelia Earhart yang terkenal, Hank Azaria sebagai raja Mesir Kahmunrah yang kejam dan Christopher Guest sebagai raja Rusia yang lalim. Robin Williams kembali berperan sebagai Teddy Roosevelt dan Owen Wilson sebagai cowboy Jedediah.

Kejadiannya bertempat di Smithsonian Institution yang merupakan museum terbesar dengan koleksi benda yang hidup kembali saat malam tiba berjumlah lebih dari 136 juta, mulai dari pesawat yang digunakan Amelia Earhart terbang sendirian melewati samudera Atlantik, daftar kejahatan Al Capone dan kursi malas Archie Bunker.